李毓龙实验室在Nature Biotechnology发文报道开发新型催产素荧光探针，揭秘神经肽的时空动态调控
2023年1月2日，北京大学生命科学学院、IDG麦戈文脑科学研究所李毓龙实验室，在《Nature Biotechnology》期刊在线发表了题为“A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments”的研究论文，报道了新型可遗传编码的催产素荧光探针GRABOT1.0及其在活体动物中的应用；结合新的工具，该文深入探究了催产素释放的分子机制。
李毓龙实验室一直致力于系统性地发展神经化学分子的检测技术，先后开发了针对胆碱类、单胺类、嘌呤类和脂类神经递质/调质的荧光探针，此次报道的GRABOT1.0是该系列的第一个神经肽类荧光探针，进一步拓展了GRAB荧光探针家族。
催产素（Oxytocin，OT）是一种由九个氨基酸组成的神经肽，在哺乳动物的内分泌系统和中枢神经系统中发挥着不可或缺的作用。催产素主要由位于下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）和视上核（supraoptic nucleus，SON）的催产素能神经元合成，并被储存于大致密核心囊泡（large dense-core vesicle，LDCV）中。催产素一方面通过垂体后叶释放进入血液循环，调节分娩和哺乳行为；另一方面通过胞体树突和投射到其他脑区的轴突末梢释放到大脑中，调节配偶结合、母婴关系和社会认知等重要社会行为。OT通过激活G蛋白偶联受体（GPCR）家族的催产素受体（oxytocin receptor，OTR）发挥功能，OT/OTR信号的失调与焦虑、自闭症和精神分裂症等多种负性情绪和精神疾病紧密相关。尽管催产素参与上述诸多生理病理过程，并发挥重要的调节功能，但其在体内释放的时空动态及分子机制尚不明晰，主要技术瓶颈在于缺乏灵敏、特异、非侵入式、且具有高时空分辨率的探针，用以追踪其动态变化。
李毓龙实验室运用GRAB探针策略 (GPCR-Activation Based Sensor)，将循环重排的绿色荧光蛋白cpGFP嫁接到催产素受体OTR的第三个胞内环，通过对不同物种来源的OTR的筛选和连接肽段的系统优化，最终基于牛的催产素受体（bovine OTR）开发得到了表现最好的OT荧光探针GRABOT1.0（简称为OT1.0）。在体外培养的HEK293T细胞和原代神经元中，OT1.0探针表现出优异的细胞膜定位。神经元表达的OT1.0探针对外源加入的催产素有~450%的荧光信号响应（ΔF/F0）和~3nM的亲和力（EC50）（图1）。此外，OT1.0探针能够在亚秒级（~0.5s）时间尺度上响应胞外OT浓度变化，且几乎不激活GPCR下游信号通路，因而对细胞的正常生理活动没有明显影响。
图1：OT1.0探针在HEK293T细胞和原代培养神经元上的表现
那么OT1.0是否能用于检测内源催产素的释放呢？作者借助AAV病毒将OT1.0探针表达在催产素能神经元轴突投射的中脑腹侧背盖区（ventral tegmental area，VTA），成功记录到小鼠急性脑切片中电刺激引起的轴突OT释放。此外，作者发现下丘脑室旁核（PVN）胞体树突释放的催产素也能被OT1.0探针检测到。有意思的是，进一步的药理学实验表明催产素在胞体和轴突末梢的释放是依赖于截然不同的钙通道：OT在胞体树突的释放主要由L型电压门控钙通道介导，而其在轴突末梢的释放则主要由N型电压门控钙通道介导（图2）。
图2：OT1.0探针在小鼠急性脑切片中检测内源催产素的释放
前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）作为社交行为的关键脑区，表达催产素受体并接受PVN中OT神经元的轴突投射。为了研究OT1.0探针能否用于报告活体动物脑中催产素的动态变化，作者首先在OT神经元中特异地表达光遗传学工具ChrimsonR，并在PFC中表达OT1.0探针。运用光纤记录技术，作者成功在自由活动的小鼠中检测到OT神经元激活引起的催产素释放。进一步运用OT1.0探针记录雄鼠交配过程中各脑区的胞外催产素水平，作者发现OT信号在交配行为的不同阶段存在脑区特异的动态变化（图3）。这些发现进一步证实了OT1.0探针在体应用时具备高灵敏度、优异的信噪比和快速的动力学。
图3：OT1.0探针报告自由活动的小鼠在光遗传激活及交配行为时大脑中的催产素信号
综上所述，在这项工作中作者开发了新型遗传编码的催产素荧光探针，实现了体外和在体情况下对胞外催产素的高时空分辨率的记录，并报道了催产素在神经元轴突末梢和胞体树突两种释放模式的分子机制异同点，为理解神经肽功能的复杂性提供了新的参考。
值得一提的是，李毓龙课题组近期还发展了多种神经肽类的GRAB荧光探针，包括促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、生长抑素（SST）、胆囊收缩素（CCK）,血管活性肠肽（VIP）,神经降压素（NTS）和神经肽Y（NPY）等（Wang H et al., bioRxiv, 2022）。此外，瑞士苏黎世联邦理工学院的Tommaso Patriarchi团队和日本金泽大学的Daisuke Ino团队也分别开发了用于检测食欲素和催产素的荧光探针OxLight1（Duffet L et al., Nature Methods, 2022）和MTRIAOT（Ino D et al., Nature Methods, 2022）。相信这些新型成像工具的开发，将会在分子和神经环路层面推动科研人员更加深入地理解神经肽信号传递在生理和病理条件下的功能和调控机理。
北京大学生命科学学院、IDG麦戈文脑科学研究所李毓龙教授为本文通讯作者；北京大学生命科学学院博士研究生钱统瑞、博士毕业生王欢和首都医科大学附属北京朝阳医院的王鹏博士为本论文的共同第一作者；北京大学博士研究生耿岚、王蕾等对文章做出了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心罗敏敏实验室，美国纽约大学的Dayu Lin实验室，瑞士洛桑大学的Ron Stoop实验室，以及德国海德堡大学的Valery Grinevich实验室的通力合作，并得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、深港脑科学创新研究院、峰基金等机构和经费的大力支持。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01561-2