撰稿：杨雨晴, 审核：李毓龙

  10月26日，北京大学IDG麦戈文脑科学研究所邀请北京脑科学与类脑研究所吴江来研究员，在金光楼邓祐才报告厅作了精彩的学术报告，标题为“Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo”。李毓龙教授主持报告会。本期学术笔记由该报告整理而成。

　　自1990年Winfried Denk发明第一台双光子显微镜以来[1]，双光子显微成像技术凭借其光学层切能力和更深成像深度等优势，已经被广泛应用于活体动物成像研究。

　　近年来，各类新型荧光探针的开发极大地丰富了脑功能可视化研究的手段，同时也对双光子显微技术在成像速度、视场、分辨率、灵敏度等方面提出了更高的要求。例如，一个动作电位的带宽往往在毫秒量级，为了利用电压荧光探针通过成像方式记录神经元的高速放电活动，需要成像速度超过1000 帧每秒，然而目前基于共振扫描头的成像频率最高能达到16 kHz线扫，即数十帧每秒，远不能满足要求；而基于光声或光电效应的扫描则需要在不同程度上牺牲成像分辨率来提升成像速度。

　　吴江来研究员在香港大学Kevin K.M. Tsia实验室进行博士和博士后研究期间，开发了基于free-space angular-chirp-enhanced delay (FACED)的成像方法，并将FACED技术与时间延伸光学显微镜结合，成功实现了对微流控芯片中高速流动的细胞样品进行80 MHz线扫的超高速成像，细胞高速(2 m/s)流动时，依然能够获得清晰图像 [2]。此后，吴江来博士在加州大学伯克利分校Na Ji实验室继续博士后研究，将FACED技术拓展到双光子显微镜上，开发了基于FACED的双光子成像系统（FACED-2PM）。

　　FACED技术来源于光纤中的脉冲展宽机制，其核心部分是由一组两个近乎相互平行的平面镜构成的光学腔。被N等分的平行的脉冲激光 (1, 2, …, N) 由柱透镜汇聚到光学腔内。由于构成光学腔的两个透镜并不完全平行，入射的脉冲激光经过多次反射后会从入口处离开光学腔。对于N等份的入射脉冲激光，由于入射角度不同、反射次数不同，其到达焦面的过程会存在延时。在基于FACED的双光子成像系统中，用FACED技术能够实现传统双光子中振镜扫描的效果，线扫描频率取决于入射脉冲激光的重复频率。使用1 MHz的脉冲激光，可以轻松实现千帧每秒的双光子成像。（图1）

　　图1：FACED成像原理示意图

　　基于FACED的双光子显微镜是否能在活体中进行高分辨率和高速的成像呢？吴江来研究员利用斯坦福大学Michael Lin实验室开发的ASAP3电压荧光探针，验证该显微镜是否能记录活体小鼠中的神经元电信号[3]。他们在小鼠的V1脑区注射病毒表达ASAP3探针，并通过基于FACED的双光子显微镜记录自发的神经元放电，记录得到的ASAP3探针的上升时间和下降时间分别为约 2 ms和约 3 ms，荧光响应幅度为10%，该结果与Michael Lin实验室在开发ASAP3期间获得的刻画结果一致。(图2)

　　图2：FACED-2PM记录活体小鼠神经元的电压探针荧光信号

　　用移动光栅刺激清醒状态下的小鼠，记录其大脑皮层V1神经元感觉诱发的超阈值和亚阈值电位活动。对有方向偏好的选择性神经元，可以观察到，当光栅处于非偏好方向时，这些神经元只表现出极小的电压响应，但对于偏好方向表现出强烈的亚阈值活动和尖峰放电。通过记录神经元对八个不同方向光栅响应的放电频率和亚阈值荧光响应的变化评估神经元的方向偏好性，结果与此前报道的通过电生理记录的结果基本一致。

　　最后，利用该系统评估视觉刺激到达V1的时间。统计结果显示，对于记录的神经元群体，其亚阈值活动的最大值在视觉刺激开始后约 57 ms出现，而放电频率的最大值在刺激开始后约 60 ms出现，该结果同样与此前报道的电生理记录吻合。

　　总的来说，基于FACED的双光子显微镜在50 × 250 μm2的视野中，能够以亚细胞分辨率和千赫兹速率对神经元电活动进行双光子成像。（图3）

　　图3：FACED-2PM记录活体小鼠对视觉刺激的电压探针荧光信号

　　在讲座的最后，吴江来研究员对他当前主要的研究方向进行了介绍，包括进一步扩大FACED的视场范围以同时记录更多神经元，以及将FACED系统应用于荧光寿命成像，拓展荧光成像的信息维度等。

　　参考文献

　　[1] Denk W, Strickler JH, Webb WW. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 1990 Apr 6;248(4951):73-6. doi: 10.1126/science.2321027. PMID: 2321027.

　　[2] Wu JL, Xu YQ, Xu JJ, Wei XM, Chan AC, Tang AH, Lau AK, Chung BM, Cheung Shum H, Lam EY, Wong KK, Tsia KK. Ultrafast laser-scanning time-stretch imaging at visible wavelengths. Light Sci Appl. 2017 Jan 27;6(1):e16196. doi: 10.1038/lsa.2016.196. PMID: 30167195; PMCID: PMC6061895.

　　[3] Wu J, Liang Y, Chen S, Hsu CL, Chavarha M, Evans SW, Shi D, Lin MZ, Tsia KK, Ji N. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 2020 Mar;17(3):287-290. doi: 10.1038/s41592-020-0762-7. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32123392; PMCID: PMC7199528.